Principper for nukleinsyresyntese

Nukleinsyresyntesen udføres ved hjælp af fastfase sialinamidtriglyceridmetoden, hvorved 3'-enden af ​​DNA'et immobiliseres på et fastfasesubstrat, og nukleotider tilsættes i 3'- til 5'-retningen, indtil det ønskede DNA-fragment er syntetiseret .Dette adskiller sig fra DNA-syntese ved anvendelse af DNA-polymerase.

3'-enden af ​​den første base er immobiliseret på CPG under syntese, 5'-OH af den næste base er beskyttet med di-p-tolyl trityl DMT, aminogruppen på basen er beskyttet med benzoesyre og 3' -OH aktiveres derefter med en aminophosphatforbindelse.1 base af 5 5'-OH af 1 base og 3'-OH af den næste base danner et phosphit-triglycerid, som derefter oxideres med jod til et phosphat-triglycerid, beskyttelsesmidlet på den anden base 5'-OH fjernes vha. tilsætning af dichloreddikesyre DM cykler gennem tilsætning af den næste base, og efter syntese fjernes beskyttelsesmidlet på 5'-OH med en svag syre. Fragmentet kobles fra den faste harpiks med koncentreret ammoniumhydroxid, beskyttelsesmidlet fjernes fra basen med koncentreret ammoniumhydroxid under opvarmning fjernes ammoniumhydroxidet, fragmentet vakuumtørres, og nukleinsyren renses ved væskekromatografi eller PAGE.

Trin af oligosyntese

Afblokering

Det5-ende DMT-beskyttelsesgruppe fjernes ved at tilføje TCA-opløsning.

Aktivering

Blanding af aktivatoren med oligonukleotidmonomeren for at danne det aktive oligonukleotidmonomermellemprodukt.

Kobling

Den 5-terminale hydroxylgruppe reagerer med det aktive oligonukleotidmellemprodukt i en antigenerativ kondensationsreaktion for at danne en ustabil phosphittriglyceridbinding.

Afdækning 

Tilsætningen af ​​et capping-middel udfører en acetyleringscapping-reaktion med overskydende hydroxylgrupper, der ikke er involveret i kondensationsreaktionen.

Oxidation 

Tilsætning af iodopløsning indeholdende vand reagerer med ustabile phosphitbindinger ved oxidation for at danne stabile phosphorsyretriglyceridbindinger.

Cyanoethyl-spaltning

Nukleinsyreproduktet efter syntese med tilsætning af DEA-opløsning for at fjerne cyanoethylgruppen fra phosphattriglyceridbindingen.

Spaltet og afbeskyttelse

Nukleinsyrefragmenterne spaltes fra fastfasebæreren ved tilsætning af en koncentreret ammoniumhydroxidopløsning og opvarmes derefter for at fjerne beskyttelsesgrupperne fra basernes hydrogenbindinger.